О. В. МОСИН

Московская государственная академия тонкой химической технологии им. М. В. Ломоносова, 117571

Биосинтетическое получение дейтериймеченного L-фенилаланина, секретируемого метилотрофным мутантом Brevibacterium rnethylicum

На примере L-фенилаланинсекретирующего мутанта Brevibacterium methylicum продолжены исследования по использованию метилотрофных бактерий для биосинтетического получения аминокислот, меченных стабильными изотопами. Представлены данные по адаптации L-фенилаланинсекретирующего метилотрофа В, methylicum к максимальной концентрации дейтерия в среде: 98% D2O и 2% CD3OD по объему. Разработанный метод позволяет получать изотопно-меченный L-фенилаланин разной степени изотопного обогащения, вплоть до полной замены атомов водорода на дейтерий, что подтверждено данными масс-спектрометрического анализа. Контроль биосинтетического включения дейтерия в секретируемые аминокислоты был осуществлен с использованием производных типа метиловых эфиров N-дансил-аминокислот и последующей масс-спектрометрией электронного удара.

Метилотрофные бактерии - группа микроорганизмов, способных расти на метаноле и других восстановленных производных углерода, являются весьма притягательными биотехнологическими объектами, возможности практического применения которых реализованы явно недостаточно [1, 2].

Одним из наиболее важных направлений работ с метилотрофными микроорганизмами являются исследования, направленные на поиск или конструирование новых продуцентов аминокислот и других биологически активных соединений. В плане начатых исследований по получению аминокислот, меченных стабильными изотопами [3 - 6], практический интерес представляет использование метилот-рофов, особенно продуцентов аминокислот для получения целевых соединений за счет биоконверсии низкомолекулярных меченых субстратов. Традиционным подходом при этом остается селекция продуцентов биологически активных соединений (БАС) [7,8].

Безусловно, наиболее целесообразным является использование облигатных метилотрофов, которые способны ассимилировать меченые Ci-субстраты в качестве единственного источника углерода [9]. Как было показано на примере L-лейцинсскретирущего облигатного метилотрофа Methylobacillus flagellatum, полная замена в среде метанола на его 13С-аналог практически не сказывается на величине лаг-фазы и уровне накопления биомассы, а степень биосинтетического изотопного обогащения характеризуется главным образом изотопной чистотой 13Ci-субстрата [3].

Известно, что исчерпывающее биосинтетическое обогащение дейтерием бактериальных микроорганизмов при высоких концентрациях изотопа в среде может вызвать ингибирование биосинтеза клеточных протеинов и тем самым замедлить бактериальный рост [10]. В отличие от микроводорослей [11], бактерии весьма чувствительны к высокому содержанию дейтерия в среде и, как правило, не способны выдерживать концентрации оксида дейтерия более чем 75 % [4, 12]. В связи с этим разработка способов возможной адаптации метилотрофных микроорганизмов к максимальному содержанию дейтерия в среде представляется очень актуальной.

Целью данной работы было исследование динамики роста микробной биомассы и секреции деитериймеченного L-фенилаланина лейцинзависимым мутантом В. methylicum за счет биоконверсии дейтеро-метанола на средах с тяжелой водой разного уровня дейтерирования.

УСЛОВИЯ ЭКСПЕРИМЕНТА

Исходный штамм поддерживали на агаризованной (2 %-ный агар) среде М9 [13] с метанолом (2 %). Штаммы хранили в водном 70 %-ном растворе глицерина при -10?.

Адаптированный к максимальному содержанию дейтерия в среде лейциновый ауксотроф В. methylicum был получен в серии пассажей с последовательным отбором хорошо растущих клонов на агаризованных средах (с 2 % дейтерометанолом по объему), содержащих ступенчатое увеличение концентрации дейтерия (начиная с нсдсйтерированных сред, вплоть до полной замены воды и метанола на их дсйтерированные аналоги).

Адаптированный к дейтерию штамм В. methylicum поддерживали на агаризованных средах М9 (см. выше) с максимальным содержанием дсйтерокомпонентов.

Для приготовления питательных сред с различным содержанием дейтерометанола и тяжёлой воды использовали соли марки "х. ч.", D2О (99,9 % D) и CD3OD (99,6 % О), полученные из Всесоюзного центра "Изотоп" (Санкт-Петербург, РФ), а также L-лейцин (Reanal, Венгрия). Для получения производных аминокислот использовали N-диметиламинонафталин-5-сульфо-хлорид дансилхлорид) (Sigma, США) и диазометан. Для получения диазометана применяли N-нитрозо-метилмочевину, закупленную у Merck (Германия).

Посевной материал выращивали до ранней фазы экспоненциального роста бактериальной культуры на средах разного уровня дейтерирования, затем вносили в ферментационные среды с соответствующим изотопным насыщением тяжёлой водой и дейтерометанолом (таблица) в количестве 5 об. % и культивировали, как описано ниже.

Влияние изотопного состава питательной среды на величину лаг-фазы, выход биомассы и время генерации В. methylicum

Номер

Опыта Компоненты среды, об. % Лаг-фаза, ч Выход биомассы, % от контрольного Время генерации, ч

Н20 D20 CH3OH CD3OD

1 98 0 2 0 24 100 2,2
2 98 0 0 2 30 92 2,4
3 73,5 24,5 2 0 32 90 2,4
4 73,5 24,5 0 2 35 86 2,6
5 49 49 2 0 40 70 3,0
6 49 49 0 2 44 60 3,2
7 24,5 73,5 2 0 46 56 3,5
8 24,5 73,5 0 2 49 47 3,8
9 0 98 2 0 60 33 4,4
10 0 98 0 2 64 30 4,8
Данные приведены для В. methylicum, не адаптированного к средам с высоким содержанием дейтерия.

Выращивание посевного материала и ферментацию проводили на синтетической среде М9 [13] с десятикратным избытком NH4Cl (так как в предварительных экспериментах по оптимизации состава питательных сред показано, что такое увеличение концентрации хлористого аммония в среде стимулирует биосинтез L-фенилаланина несмотря на некоторое увеличение продолжительности лаг-фазы) и L-лсйцином. После стериллизации рН доводили до величины 7,0-7,2 при помощи NaOH. В качестве источника углерода использовали метанол (2 % от объема среды) или его дейтериймеченный аналог.

Культивирование бактерий проводили при 37 С в условиях интенсивной аэрации растущей культуры в колбах емкостью 750 мл с наполнением 100 - 150 мл среды. Морфологию клеток В. methylicum исследовали с помощью поляризационно-интерфсрснци-онного микроскопа "Biolar" (Польша). Рост культуры контролировали на спектрофотометре "Beckman DU 6" (США) при 620 нм.

Все эксперименты по биосинтетическому включению дейтерия проводили параллельно с контрольным (см. таблицу) на стандартной недейтерированной среде.

Для каждого эксперимента по биосинтетическому введению дейтериевой метки в В. methylicum клетки на ранней фазе экспоненциального роста осаждали центрифугированием (10000 мин -1, 5 мин). После отделения биомассы супернатант лиофилизовали. Сухой остаток супернатанта, содержащий фенилаланин, переводили в метиловые эфиры N-дансил-производных аминокислот, как описано в работе [3].

ТСХ осуществляли на пластинках "Silufol" (Че-хо-Словакия) в системах: (А) - изопропанол-аммиак (7:3) и (Б) - хлороформ-метанол-ацетон (7:1:1). Количественное определение секретируемого фенилаланина производили методом ТСХ на пластинках "Silufol" в системе (А). Образцы КЖ объемом 10 мкл наносили на пластинки. Элюирование проявленных нингидрином пятен фенилаланина проводили 0,5 %-ным раствором хлористого кадмия в 50 %-ном этаноле. Концентрацию аминокислоты определяли спектрофотомстрически с использованием кривой корреляции при X 540 нм.

Очистку метиловых эфиров N-дансил-производных аминокислот из КЖ, содержащей дейтерий, осуществляли с помощью колоночной (150 х 40 мм) хроматографии на силикагеле L 40/100 (Chemapol, Чехо-Словакия) с градиентной элюцией системой хлороформ-метанол (от 0 до 10 % метанола).

Детекцию при ТСХ проводили 0,2 %-ным раствором нингидрина в ацетоне. N-Дансильные производные аминокислот идентифицировали в системе (Б) по характерной флуоресценции в УФ-свете.

Аминокислоты идентифицировали сопоставлением их спектральных и хроматографических характеристик с литературными данными [14], сравнением со стандартными аналогами, а также подтверждали данными масс-спсктрометричсского (МС) анализа их производных.

Масс-спектры электронного удара производных аминокислот измерены на приборе МВ-80 A (Hitachi, Япония) при энергии ионизирующих электронов 70 эВ.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Как известно, большинство микроорганизмов, распространенных в природе, к которым относятся ме-тилотрофы, не могут служить хорошими продуцентами ароматических аминокислот, вследствие наличия эффективных механизмов регуляции биосинтеза этих соединений в микробной клетке, хотя эта способность появляется у ряда их мутантных форм [15 - 17]. Активными микробными продуцентами L-фснилаланина являются, как правило, мутанты, у которых снят негативный контроль со стороны таких ключевых ферментов биосинтеза этой аминокислоты, как префенатдегидратаза (ПД) и дезоксиарабиногептулозофосфатсинтстаза (ДАГФ-синтетаза) [18, 19].

Определенный интерес в связи с этим представляет исследование способности продуцировать L-фенилаланин лейцинзависимым метилотрофным мутантом В. methylicum, достаточно удобным, хотя и малоизученным объектом для биотехнологического применения. Поэтому начальный этап биохимических исследований В, methylicum был связан с получением ауксотрофных мутантов, для которых в большинстве случаях характерны ограниченный спектр мутантных фенотипов и кроме того довольно высокий уровень реверсий [20 - 23].

Исходный лейцин-зависимый штамм В. methylicum, продуцент L-фенилаланина, был отобран в лаборатории генетики метилотрофов НИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов на предыдущем этапе работы после обработки В. methylicum нитрозогуанидином по устойчивости к аналогу фенилаланина метафторфенилаланину (50мкг/мл.). Выделенные таким образом аналогорезистентные мутанты конвертировали метанол и накапливали при этом фенилаланин в ферментационной среде. Сравнительные анализы аминокислоты методом тонкослойной хроматографии и масс-спектрометрии показали, что фенилаланин, секретируемый В. mcthylicum, полностью идентичен коммерческому L-фенилаланину.

Мы изучали влияние степени замещенности дейтерием низкомолекулярных субстратов воды и метанола в составе питательных сред на рост полученного ауксотрофа, величину лаг-фазы и времени клеточной генерации (см. таблицу), а также секрецию дейтериймеченного фенилаланина. Продолжительность лаг-фазы, время генерации и максимальная секреция фенилаланина В. melhylicum в условиях изотопных экспериментов (см. таблицу, опыт 2, 4, 6, 8, 10) представлены на гистограмме (рис. 1).

Как видно из представленных данных, в отсутствие дейтериймеченных субстратов при росте исходной бактерии на протонированной среде продолжительность лаг-фазы не превышала 24 ч (см. таблицу, опыт 1). С увеличением содержания тяжёлой воды в среде продолжительность лаг-фазы увеличивалась до 64 ч на средах с 98 % D2O и 2 % CD3OD по объему (см. таблицу, опыт 10).

Если замена метанола на его дейтерированный аналог не вызывала существенного ингибирования роста бактерий и не сказывалась на выходе микробной биомассы, то на средах с высоким содержанием оксида дейтерия микробный рост был заметно подавлен. Вследствие этого в экспериментах, где оксид дейтерия преобладал в среде (см. таблицу, опыт 9, 10), выход биомассы был значительно ниже, чем в контрольных экспериментах и в тех случаях, когда использовали простую воду и дейтеро-метанол (см. таблицу, опыт 2).

Как видно, длительность времени генерации бактериальной культуры с увеличением изотопного насыщения среды дейтерием увеличивается. Из данных таблицы видно, что продолжительность лаг-фазы и время клеточной генерации бактерии при переходе со стандартной на дейтерированные среды находятся в определенной корреляции. Так например, в условиях эксперимента 10 продолжительность лаг-фазы увеличивается в 2,6 раза, а время генерации возрастает в 2,2 раза.

С целью увеличения эффективности изотопного мечения клеточных БАС и аминокислот и интенсификации роста метилотрофа на полностью дейтерированных средах мы адаптировали полученный мутант В. methylicum к максимальному содержанию дейтерия в среде культивирования. Для этого были проведены пять серий адаптационных пассажей на агаризованных средах (с 2 % СD3ОО по объему) при ступенчатом увеличении концентрации оксида дейтерия в них (см. таблицу). Последовательно отбирали наиболее продуктивные по уровню накопления дейтерированной биомассы клоны В. methylicum и пересевали их на среды с большей степенью дейтерирования, вплоть до полной замены воды и метанола на их дейтерированные аналоги (выживаемость на полностью дейтерированных средах не более 40 %). Полученный в результате ступенчатого отбора штамм В. methylicum, адаптированный к дейтерию, переносили затем с максимально насыщенных дейтерием агаризованных сред на жидкие среды М9, приготовленные исключительно из 98 %-ной тяжёлой воды (99,9 % D) и содержащие 2 %-ный дейтерометанол, и культивировали, как описано в эксперименте.

Динамика роста бактерии В. mеthylicum, адаптированного к высокому содержанию дейтерия в среде, и способность секретировать L-фенилаланин в условиях максимально насыщенных дейтерием сред представлены на рис. 2.

Выход биомассы, время генерации и максимальная секреции фенилаланина исходным мутантом (10) и мутантом, адаптированным к высокому содержанию дейтерия в среде (10'), на средах, максимально насыщенных дейтерием, приведены в гистограмме на рис. 3 относительно контрольного (1). Сравнивали ростовые данные адаптированного к дейтерию метилотрофа и секрецию фенилаланина (опыт 10') с исходным В. methylicum на стандартной среде М9 (опыт I) и на полностью (98 % D2О) дейтерированных средах с 2 %-ным дейтерометанолом (опыт 10).

Как видно из графиков на рис. 2, степень замещенности дейтерием воды и метанола не оказывает значительного влияния на секрецию фенилаланина, в то время как выход микробной биомассы на дейтерированной среде значительно уменьшается. Незначительное снижение уровня секреции фенилаланина (до 0,5 г/л) наблюдалось лишь в изотопных экспериментах (см. рис. 2, 10 б), когда использовали исходный метилотроф на средах с максимальным насыщением дейтерием.

Уровень накопления микробной биомассы адаптированным метилотрофом на полностью дейтерированной среде выше, чем для исходного В. methylicum (см. рис. 2, 10 а) , несмотря на двухкратное увеличение продолжительности лаг-фазы (рис. 2, опыт 10' а), в то время как секреция фенилаланина у адаптированного метилотрофа существенным образом не отличалась от таковой на недейтерированной среде. В отличие от адаптированного к дейтерию В. methylicum, рост исходного мутанта на полностью дейтерированной среде с 98%-ной тяжёлой водой сильно ингибируется дейтерием (см. рис. 2, 10 и).

Параметры бактериального роста адаптированного к тяжёлой воде метилотрофа показаны на рис.3.

Как видно из рис. 3, время клеточной генерации для адаптированного метилотрофа (2,5 ч) близко к исходному на стандартной среде. Несложный селекционный подход позволил получить штамм В. methylicum, способный конвертировать дейтерометанол на максимально насыщенных дейтерием средах в клеточные БАС и секретирусмый L-фенилаланин. При этом выход фенилаланина у адаптированного мутанта не сократился. Таким образом, было показано, что некоторые виды метилотрофных бактерий, например, факультативный метилотроф В. methylicum, в принципе могут быть адаптированы к высокому содержанию дейтерия в среде без потери ростовых и биосинтетических способностей бактериальной культуры.

Механизм биосинтеза L-фенилаланина В. methylicum и роль лейцина в этом процессе не объяснены окончательно.

Что же касается самого фенилаланина, то он, как известно, синтезируется в клетках микроорганизмов и, в частности, в коринебактериях из своего предшественника - префеновой кислоты, которая через стадию образования фенилпирувата превращается в фенилаланин под действием клеточных трансаминаз [24 - 26] .

Продолжая обсуждать механизм секреции фенилаланина этим метилотрофом следует отмстить, что общей особенностью сскретируемой целевой аминокислоты было значительное увеличение ее продукции на ранней фазе экспоненциального роста В. mehtylicum, когда выход микробной биомассы был незначителен (см. рис. 2). Затем во многих экспериментах наблюдалось, как правило, ингибирование биосинтеза фенилаланина на поздней фазе экспоненциального роста и снижение его концентрации в среде.

Как показали микроскопические наблюдения за растущей популяцией микроорганизмов, подобный характер динамики секреции фенилаланина не коррелирует с качественными изменениями ростовых характеристик культуры на различных стадиях роста, что служит подтверждением морфологической однородности микробной популяции.

По-видимому, накопленный в процессе роста фенилаланин ингибировал ферменты собственного пути биосинтеза. Кроме того, как показано еще на других микробных продуцентах L-фенилаланина при культивировании микроорганизмов без рН-статирования не исключено обратное превращение экзогенного фенилаланина в интермедиаторные соединения его биосинтеза [25, 26].

Кроме основной сскретируемой аминокислоты в среде, как правило, присутствуют следовые количества других аминокислот (аланин, валин, а также тирозин и триптофан) и других метаболитов, четко детектируемых масс-спектрометрическим анализом [3].

Степень биосинтетического обогащения секретируемого L-фенилаланина была определена масс-спектрометрическим анализом метиловых эфиров N-дансильных производных аминокислот методом электронного удара. Согласно сравнительным данным масс-спектрометрического анализа производных нативного и дейтерироваиного фенилаланина со сред разного уровня дейтерирования (см. таблицу), степень биосинтетического включения дейтерия в молекулу фенилаланина коррелирует с концентрацией дейтерия в среде. Так например, в масс-спектре дейтерированного производного фенилаланина (молекулярная масса недейтерированного соединения 412), полученного из В. methylicum в условиях максимального насыщения среды дейтерием (см. таблицу, опыт 10), четко детектируется высокоинтенсивный пик молекулярного иона с m/z 418 (М+ + 6) и менее интенсивный пик с примесью m/z 417 (М.++ 5).

Данные по уровням дейтерированности биосинтетического фенилаланина свидетельствуют о высокой степени включения дейтерия в молекулу фенилаланина в условиях полной замены воды и метанола на D2О и СDзOD, что составляет (с учетом точности метода) 5-6 атомов из 8 детектируемых по скелету молекулы. При этом лсгкообмсниваемые атомы D(H) амино- и карбоксильной групп не рассматриваются как легкообмениваемые на дейтерий.

Основными преимуществами В. methylicum, адаптированного к максимальному содержанию дейтерия в среде и способного конвертировать дейтеро-метанол для получения униформно дсйтерированных аминокислот и белка (в отличие от некоторых традиционных способов с использованием других микробных продуцентов [27, 28] и микроводорослей [29]) являются хорошие ростовые и биосинтетические способности этого метилотрофа на максимально дейтерированных средах.

При помощи адаптированного штамма В. methylicum можно достаточно быстро наработать в лабораторных условиях граммовые количества дейтерированного L-фенилаланина. Таким образом, использование в прикладных целях полученного в настоящей работе мутанта В. methylicum, адаптированного к полностью дейтериро-ванным средам, содержащим тяжёлую воду и дейтеро-метанол и, в частности, для биосинтетического получения фенилаланина разной степени обогащенности дейтерием {вплоть до полной замены всех атомов водорода на дейтерий) является весьма эффективным.

В заключение следует отметить, что более высокая эффективность изотопного мечения клеточных БАС может быть обеспечена путем полной замены протонированных компонентов среды на их дейтерированные аналоги, а также используя лейцин, униформно меченный дейтерием, который в принципе можно получать из гидролизатов тотального белка биомассы этого метилотрофа. Анализ биосинтетического включения дейтерия в аминокислоты тотального белка биомассы опубликован отдельно.

ЛИТЕРАТУРА

1. Романовская В. А., Мохамед эль Сайд II Микробиология. -1986. - Т. 48. - ? 2. - С. 97 - 107.

2. Никонова Е. С., Доронина Н. В., Троценко Ю. А. II Прикл. биохим. и микробиол. - 1986. - Т. 22. - С. 557 - 561.

3. Karnaukhova Е. N., Resheiova О, S., Semenov S. I. et al. / Amiiio Asids. - 1993. - V. 4. - P. 1 -14.

4. Skladnev D. A., Baev M. V., Shilova S. / Proceedings of 6th Europ. Conf. on Biomass for Energy, - Industry and Enviroment. - Athens. - 1991. - P. 47 - 51.

5. Skladnev D. A., Reshetova O. S. II J. Pharm. Belg. - 1992. - V. 47. - ? 3. - P. 216.

6. Pshenichnicova А. В., Reshetova O. S. it Abstr. of 4th International Meeting on Bio-Chroma to graphy and Molecular Biology. - La Grand Motte. France, 1992. - ? 63.

7. Tsygankov Y. D., Kasakova S. M. (I Arch. Microbiol. - 1987. V. 149. - P. 112 - 119.

8. Stone S., Goodwin P. M. II J. General Microbiol. - 1989. - V. 135. p. 227 235.

9. Patent USA ? 0220951, 1988.

10. Borek E., Rittenberg D. II Proc. Natl. Acad. ScL - 1960. - V. 46. - P. 777.

11. Keiko Vnno., Hiroki Busujima., Shegeki Shimba. / Chem. Pharm. Bull. - 1988. - V. 36. - ? 6. - P. 1828 - 1833.

12. Papadimitriou C., Wenzei M. II Z. Naturforsch. - 1989. - V. 44. - S. 1053 - 1057.

13. Миллер Дж. II Эксперименты в молекулярной генетике. - М-: Мир, 1976. - С. 393.

14. Боллигер X. Р., Бреннер М., Шпшль Э. И Хроматография в тонких слоях. - М.: Мир, 1965. - С. 395 - 408.

15. 15. Shiio Jsamu. II Biotechnol. Amino Acid Prod. - Токио, 1986. - P. 188 - 206.

16. Максимова И. П., Олехнович И. II. Регуляция биосинтеза
ароматических аминокислот у метилотрофных бактерий: Биохимия и физиология метилотрофов. - Пущино, 1987. -С. 77 - 85.

17. KadziM. etal./ ActaBiotechnol. - 1990. - V. 10. _? 1.- Р 93 - 98.

18. Netrusov A. I., Dikanskaja E. M., Kulicova W. P. Biochemical specifity of asydophilik methylotrops: Abst. of 13 Intern. Cong. of Microbiol. USA. Boston. August. 1982. - Boston: Academic press, 1982. -V. 1. - P. 61.

19. WunscheL., Fischer II., KieselB. II Z. Allg. Microb. - 1983. -P. 23. - ? 3. - S. 189 - 196.

20. Noon D. M, Lindstrom M. E. II J. Bacteriol. - 1986. -V. 166. - P. 581 -590.

21. Levering P. Д., Tiesma L., Woldedorp J, P. et al. / Arch. Microbiol. - 1987. - V. 146. - P. 346 - 352.

22. Клецова Л. В., Говорухина Н. И. и др. / Микробиология. - 1987. - Т. 56. - Вып. 6. - С. 901 - 906.

23. Whitta S., Sinclair M. I., Holloway В. W. II J. Gen. Microbtol. - 1985. - V. 131. - P. 1547 - 1549.

24. Fazel A. M. et al. / J. Bacteriol. - 1979. - V. 138. - P. 805 - 815.

25. Stenmark S. L., Pierson D. L., Glover G. I. et al. / Nature (London). - 1974. - V. 247. - P. 290 - 292.

26. Ворошилова Э. Б., Гусяпшнер М. М., Жданова II. И. и др. / Биотехнология. - 1989. - Т. 5. - ? 2. - С. 137 - 141.

27. Рувинов С. В., Сапоровская М, В., Беликов В. М. II Изв. Акад. наук. - 1989. - ? 10. - С. 2341 - 2343.

28. Сох J., Kyle D., Radmer R. et al. / Trends. Biotechnol. - 1988. - V. 6. - P. 279 - 282.

29. Crespi II. L. Synth, and Appl. Isot. Labeled Compounds. Proc. 2nd Int. Symp., 3-6. Sept. 1985. - Amsterdam, Oxford, N.-Y., Tokyo: Elscvier, 1986. - P. Ill - 112.