О.В.Мосин

Рассмотрим что такое антибиотики и почему они так важны для человека. Термин "антибиотик" был введён З. А. Ваксманом в 1942 году. По определению антибиотики - это антимикробные вещества как правило, природного происхождения и продукты их химической модификации,подавляющие и угнетающие в ничтожно малых концентрациях рост и развитие простейших, микроорганизмов, низших грибов, вирусок и клеток злокачественных опухолей. К антимикробным средствам относят антисептики, дезинфектанты и химиотерапевтические вещества.

Антисептики - это химические вещества, неизбирательно и губительно действующие на микроорганизмы (в том числе - патогенные), находящиеся на поверхности тела и слизистых оболочек открытых полостей.

Дезинфектанты - это, в основном, антисептики, действие которых направлено на патогенные микроорганизмы, находящиеся на (в) объектах внешней среды.

Химиотерапевтаческие средства - это вещества синтетического и природного происхождения, избирательно и губительно действующие на патогенные микробы, клетки злокачественных опухолей и гельминты.

Антисептики, дезинфектанты, неорганические и синтетические химиотерапевтические средства не имеют непосредственного отношения к биотехнологии. В то же время подавляющее большинство антибиотиков получают при ферментации микробов-продуцентов, или, в других случаях, применяют антибиотическое ядро для синтеза целевого продукта - полусинтетического антибиотика. Известны единичные антибиотики, которые в настоящее время производят на предприятиях органического синтеза (левомицетин и некоторые другие).

Таким образом, определение понятия "антибиотики" теперь относят к веществам природного, полусинтетического и, реже, синтетического происхождения, которые в малых концентрациях ингибируют рост и размножение каких-либо микроорганизмов. Продуцентами одних антибиотиков (например, бацитрацина, полимиксина и др.), являются бациллы, других - актиномицеты (например, актиномицинов, гентамицинов, канамицинов), третьих - нитчатые грибы (например, гризеофульвина, пенициллинов, цефалоспоринов), четвертых - неспорообразующие бактерии (например, монобактамов).

Антибиотики - -лактамы.

Пенициллины. Пенициллин впервые получен в аморфном, а затем - в кристаллическом виде А, Флемингом, X. Флори и Е. Чейном в 1940 г. До сих пор пенициллиновые антибиотики составляют наиважнейшую группу химиотерапевтических средств. Ядром пенициллинов является 6-аминопенициллановая кислота, или 6-АПК, которую используют для получения полусинтетических пенициллинов.

Один водород в аминогруппе 6-АПК может быть заменен на какой-либо радикал (R), усиливающий или расширяющий антимикробный спектр полусинтетического производного. Обычно 6-АПК получают из бензил-пенициллина (пенициллина G).

В настоящее время в различных странах производят биосинтетические (с помощью Penicillium notatum или P.chrysogenum) антибиотики и на их основе - полусинтетические антибиотики --лактамы.

Цефалоспорины- другая обширная группа экстрацеллюлярных р-лактамных антибиотиков, в которых шестичленное дигидротиазиновое кольцо соединено с -лактамным кольцом. Благодаря этому ядром цефалоспоринов является 7-аминоце-фалоспорановая кислота, или 7-АЦК (цефемовое ядро), впервые выделенная в ходе очистки цефалоспорина С .

Известно около 20 цефалоспоринов, созданных методом полусинтеза из АЦК: цефалоридин (цепорин), цефуроксим, цефокситин, цефалотин, цефацетрил, цефалексин, цефазолин, цефаридин, цефотаксим, цефтриаксон, цефтазидим и др.

Боковые цепочки, содержащие 2-аминотиазолил как в цефотаксиме, цефтриаксоне, цефтазидиме и некоторых других, усиливают активность цефалоспоринов против стрептококков и грамотрицателъных бактерий; иминометоксигруппа в той же позиции, например, в цефуроксиме, обеспечивает стабильность антибиотика против плазмидо-опосредованных р-лактамаз, и т. д.

1- О к с а ц е ф е м ы - сходны с цефалоспоринами, у которых атом серы в дигидротиазиновом (цефемовом) кольце замещен на кислород. Представителем такой группы антибиотиков является широко спектральный латамоксеф (мексалактам), в котором 7-а-метоксигруппа стабилизирует молекулу, как таковую, равно как и придает устойчивость и к большинству -лактамаз.

Клавамы - (3-лактамные антибиотики, отличающиеся от пенициллинов тем, что в тиазолидиновом кольце последних сера заменена на кислород (клавемовое оксазолидиновое кольцо) и в позиции 6 нет боковой цепи. Такой антибиотик -лавулановая кислота изолирована Streptomyces clavuligerus. Она слабо активна против бактерий, но является потенциальным ингибитором стафилококковой лактамазы и р-лактамазы, образуемой грамотрицательными бактериями. Сочетание широкоспектральной клавулановой кислоты с -лактамазочувствительными ампициллином и амоксициллином является основой комбинированного препарата аугментин.

Карбапенемы - это новое семейство -лактамных антибиотиков, представляющих собой аналоги пенициллинов или клавамов, в которых сера у первых и кислород у вторых замещены на углерод:

К этому семейству относятся оливановые кислоты и тиенамицин.. Их продуценты - стрептомицеты. Эти антибиотики обладают широким антимикробным спектром и являются выраженными ингибиторами -лактамаз.

Нокардицины - новая группа [3-лактамных антибиотиков, продуцируемых бактериями из рода Nocardia. Выделены Нокардицины А, В, D, Е, F, G. Наиболее активным из них против грамотрицательных бактерий (но не грамположительных} оказался нокардицин А.

Монобактамы - это моноциклические монобактамные антибиотики, продуцируемые штаммами бактерий, например Pseudomonas acidophila и Gluconobacter species. Их ядром является 3-аминомонобактамовая кислота (3-АМК). Ее можно получить из природных монобактамов или из 6-АПК.

Природным высокоактивным против грамотрицательных бактерий и устойчивым к действию (3-лактамаз оказался азтреонам. Однако он не активен против грамотрицателъного анаэроба Bacteroides fragilis, способного продуцировать -лактамазу, активную против данного антибиотика. Комбинация клавулановой кислоты с монобактамами также неэффективна против этого микроба.

Антибиотики-тетрациклины - это широкоспектральные антибиотики, активные против бактерий; их продуцентами являются стрептомицеты. Некоторые тетрациклины относятся к ряду полу синтетических препаратов.

Антибиотики-гликозиды. Среди них можно выделить структуры, содержащие О-, S- и N-гликозидные связи. К числу первых относят аминогликозидные антибиотики и новобиоцин, ко вторым - клиндамицин и линкомицин, к третьим - некоторые нуклеозидные антибиотики.

Антибиотики-О-гликозиды.

Аминогликозиды - содержат аминосахара в своей структуре. Большинство из них (канамицины, гентамицины и др.) продуцируется актиномицетами; тобрамицин - аналог канамицина В (З-дезоксиканамицин В); нетилмицин является полусинтетическим производным сизомицина (N-этилсизомицин).

Все антибиотики-аминогликозиды обладают широким спектром действия на различные патогенные бактерии. Продуцентом гентамицинов является Micromonospora purpurea, а сагамицина -M.sagamiesis.

Сизомицин по строению близок тентамицинам и отличается от них лишь одним циклом. Его продуцентом является мутант Micromonospora sagamiensis KYI 1535.

Антибиотики - макролиды - имеют О-гликозидные связи; они продуцируются стрептомицетами и проявляют активность против большинства грамположительных и некоторых грамотрицательных бактерий (Neisseria spp., Haemophilus influenzae и Legionella pneumophila). На практике чаще применяют эритромицин, олеандомицин, триацетилолеандомицин и спирамицин. Они содержат в своей структуре макро циклическое лактонное кольцо, связанное с углеводными остатками, из которых аминосахар всегда располагается ближе к макролактону, чем нейтральный углевод.

Олеандомицин, его эфир - триацетилолеандомицинк спирамицин сходны по спектру антибактериального действия с эритромицином, но несколько слабее его по активности.

Новобиоцин продуцируется культурой Streptoniyces spheroides и другими видами. Антибиотик активен против возбудителей пневмонии, некоторых кишечных и раневых инфекций, ангин и флегмон. По химической структуре - это О-гликозид (амидогликозид), агликон которого существенно массивнее углеводной части.

Оливомицин - О-гликозидный антибиотик, в котором сахаристая часть представлена триаозой и биозой, между которыми как бы вставлен агликоноливин (хромомицинон).

Оливомицин является представителем большой группы антибиотиков - аналогов ауреоловой кислоты (митрамицина), активных Против грамположителъных бактерий и отдельных опухолей. Оливомицин продуцируется Streptomyces olivoreticuli.

Дауномицин (рубомицин) - О-гликозидный антибиотик из группы антрациклинов, образуемый Streptomyces species. Углеводный компонент в нем - даунозамин, или 2, 3, 6-тридезокси-З-ами-ноликсоза. Антибиотик обладает противомикробным и противоопухолевым действием.

Иммуносупрессивыым и противоопухолевым действием обладает О-гликозидный антибиотик блеомицая, содержащий также и пептидные связи. Он образуется стрептомицетом; углеводный компонент в нем представлен амидобиозой.

Растомицин А (ристоцетин) - О-гликозидный антибиотик, в составе которого имеется циклизованная агликоновая часть (циклопентит) и углеводный компонент, включающий ристозамин, маннозу, арабинозу, глюкозу и рамнозу. Ристомицин активен против грамположителъных бактерий.

Антибиотики - S-гликозиды.

Из этой группы антибиотиков наиболее известны линкомицан и клиндамицан, агликоном которых является метил. Другими словами - это метил-S-гликозиды. Из них клиндамицин является производным линкомицина, у которого гидроксил в позиции 7 заменен на хлор.

Углеводная часть обоих антибиотиков представлена 6, 8-диде-зокси- 1-тио-О-эритро-О-галакто-октапиранозой, в которой С6 имеет радикал - 1-метил-4-н-пропил-2-пирролидин-карбоксамид.

Клиндамицин лучше всасывается в кровь из кишечника. Оба антибиотика активны преимущественно против грамположителъных кокков.

Антибиотики - N-гликозиды.

Гужеротин - антибиотик широкого спектра антимикробного действия. Он продуцируется культурой Streptomyces gougerotii. По химическому строению представляет собой 1 - (цитозинил)-4-сар-козил-О-сериламино-1,4-дидезокси-(3-О-галактопиран-уронамид)

Пуромицин - N-гликозидный антибиотик, имеющий важное значение в расшифровке синтеза белка на рибосомах. Он подобен З'-концу аминоацил-тРНК, связывающемуся с определенным участком рибосомы, и действует как аналог аминоацил-тРНК, прерывая удлинение полипептидной цепи.

Продуцентом пуромицина является Streptomyces alboniger. Хотя антибиотик ингибирует многие микроорганизмы, включая трипаносомы, терапевтическое значение его невелико.

Антибиотики-депсипептиды.

Все они продуцируются, как правило, бациллами и проявляют активность против грамположительных и грамотрицательных патогенных бактерий.

К числу циклопептидных антибиотиков относят бацитрацины, грамицидины, полимиксины и др.

К циклопептидным антибиотикам относится также циклоспорин А, продуцируемый мицелиальными грибами Cylindrocarpum lucidum и Tolypocladium inflaturn-Bauveria nives. Примечательным качеством антибиотика является иммуносупрессивное действие, в связи с чем его преимущественно используют в трансплантологии, хотя он также проявляет антифунгальную активность.

Продуцент циклоспорина Tolypocladium infantum (сканирующий электронный микроскоп).

Антибиотики-актиномицинысоставляют большую группу сходных веществ, образуемых стрептомицетами. Некоторые из них обладают противоопухолевым и им-муносупрессивным действием. По химическому строению их относят к хромопептидам, содержащим феноксазиновую хромофорную группу и два пентапептида в форме циклических лактонов. На практике хорошо известен актиномицин (дактиномицин), ингибирующий ДНК-зависимый синтез РНК.

Анти биотики-полиены.

Продуцентами антибиотиков-полиенов являются стрептомицеты и некоторые мицелиальные грибы, образующие структуры с четырьмя-семью сопряженными двойными связями (тетра-, пента-, гекса- и гептаены). Из группы полиеновых антибиотиков в медицинской практике известны нистатин, фумагиллин (тетраены), амфотерицин, полусинтетический амфоглюкамин, обладающие противогрибковым действием (преимущественно - в отношении патогенных дрожжевых организмов и некоторых других диморфных грибов); фумагиллин ингибирует стафилококки, дизентерийную амебу, бактериофаги.

Нистатин (продуцент Streptomyces noursei} - аналог амфотерицина В, но в его цепочке (позиции 20-27) содержится 4 конъюгированных двойных связей. Антибиотики-нзамицины (от лат. ansa - ручка). В их молекулах к ароматическому ядру присоединяется алифатическая анза-цепь.

Анзамицины образуются актиномицетами и некоторыми растениями. Из природных и полусинтетических фамицинов наиболее известными являются: рифоцип (рифампицин SV), рифампицин и рифамид, Анзамицины - широкоспектральные антибиотики, ингибирующие бактерии, отдельные вирусы и некоторые эукариотические клетки.

Рифампицин (продуцент - Streptomyces mediterranei) расценивают одним из лучших химиотерапевтических средств при туберкулезе, проявляющим бактерицидное действие против Mycobacterium tuberculosis. Он проникает в спинномозговую жидкость и поэтому эффективен при туберкулезном менингите.

Антибиотики-стероиды - к ним относят фузидиевую кислоту, изготавливаемую в виде натриевой соли. Она образуется мицелиальным грибом Fusarium coccineum. Антибиотик активен против многих типов грамположительных бактерий, особенно - стафилококков.

Другие известные антибиотики.

Гризеофульвин - продуцируется нитчатым грибом Penicillium griseofulvum. и другими, активен против болезнетворных грибов-дерматофитов. Он состоит из конденсированных колец А, В, С.

Трахотецин - образуется нитчатым грибом Trichothecium roseum и некоторыми другими несовершенными грибами. Это - антифунгальный антибиотик, полезный, прежде всего, для для ветеринарии, и растениеводства. В своем составе содержит фиэеофульвин гетероциклы

В завершении этого рассказа о промышленных антибиотиках обсудим проблемы получения антибиотиков в промышленности. Ферментационные процессы получения антибиотиков еще не достигли того совершенства, которое могло бы быть обеспечено благодаря компьютерной технике и пониманию физиологии продуцентов. Своеобразным тормозом совершенствования технологии выступают сами клеточные популяции микроорганизмов, которые изменяются качественно и количественно в течение всего продуктивного цикла. Поэтому не удается получать полностью идентичных результатов даже в двух смежных ферментациях, равно как и весь технологический процесс удается сравнительно хорошо проводить лишь в периодическом режиме.

Так как антибиотические вещества являются вторичными метоболитами, то биосинтез их сопряжен с переходом культуры продуцента в идиофазу. Следовательно, здесь целесообразно лимитирование роста продуцента. Таким лимитирующим фактором при биосинтезе пенициллина выступает глюкоза, тогда как при биосинтезе антибиотиков стрептомицетами - фосфаты. Все это важно при компановке питательных сред, подкормке штамма - продуцента в процессе биосинтеза антибиотика. Так, среда для продукции пенициллина (она же пригодна для накопления инокулюма) включает глюкозу - 1,5%, лактозу - 5% (лактоза снимает катаболитную репрессию глюкозы), аммония сульфат и фосфаты - 0,5-1%, кукурузный экстракт - 2-3%, предшественники антибиотика - фенокси- или фенилуксусная кислота - 0,3-0,6%, мел - 0,5-1%, пеногаситель - 0,5-1%; температуру ферментации поддерживают на уровне 22-26?С при рН от 5,0 до 7,5 и аэрации 1 м3 воздуха на 1 м3 среды в I минуту; продолжительность ферментации - 4 суток.

Так называемая "всеядность" актиномицетов обеспечивает им способность расти и продуцировать антибиотики на средах, содержащих белки (соевая мука, рыбная мука, белок клейковины пшеницы и пр.), крахмал. Тем не менее, применительно к каждому продуценту имеются свои особенности, обычно отмечаемые в регламентной документации. Например, посевной материал Streptomyces kanamyceticus получают на соево-крахмальной среде и на ней же проводят основную ферментацию при 27-28?С в течение 4-5 суток при поддержании рН на уровне 7,1-7,6.

При ферментации Str. floridae (продуцент виомицина, или флоримицина) рекомендуют среду, содержащую глюкозу или гидрол, соевую муку, кукурузный экстракт, нитраты, мел; температуру поддерживают в пределах 27-29?С, рН на уровне 7,0-7,3.

В случае ферментации Str. erythreus в питательную среду добавляют пропиловый спирт, как предшественник антибиотика эритромицина.

Продуцент нистатина Str. noursei интенсивно потребляет аммонийный азот (не нитратный), и т. д.

Перед выделением антибиотика из культуральной жидкости необходимо отделить твердую, или плотную фазу от жидкой. В этих случаях, как правило, используют фильтрацию. Качество твердой фазы заметно сказывается на эффективности фильтрации. Здесь можно отметить следующую закономерность - нативная бактериальная масса фильтруется хуже мицелиальной. С учетом того факта, что высшие актиномицеты способны формировать нитчатые структуры, то их отделение при фильтрации происходит несколько легче, чем других бактерий.

Пути улучшения фильтрации: обработка ростовых сред электролитами, тепловая коагуляция, добавление фильтрующих наполнителей, кислотная коагуляция и некоторые другие.

Трудности выделения антибиотиков обусловлены многокомпонентностью культуральных жидкостей и малой концентрацией в них целевых продуктов. Так, пенициллин может накапливаться примерно до 30 г/л при 8%-м выходе от субстрата. При этом сухие выщества после отделения мицелия обычно составляют порядка 3-6%, из которых лишь 15-30% приходятся на антибиотик. Поэтому любую культуральную среду необходимо обрабатывать так, чтобы антибиотическое вещество переходило в ту фазу, из которой затем он будет наиболее полно выделен. В ряде случаев этого можно добиться подкислением (тетрациклины) или, напротив, подщела-чиванием культуральной жидкости (новобиоцин), добавлением солей, щавелевой кислоты (эритромицин) и т. д., до или после коагуляции и осаждения белков из нативных растворов.

Если для выделения антибиотика применяют ионный обмен, то нативный раствор стремятся освободить от ионов-конкурентов (растворимые оксалаты - для удаления ионов кальция; натрия триполифосфат - для связывания ионов магния; желтая кровяная соль - для комплексования ионов железа).

Антибиотические вещества, накапливающиеся в клеточной биомассе в процессе ферментации микробов-продуцентов, выделяют другими методами, нежели антибиотики, содержащиеся в культуральной жидкости. В первом случае, как правило, необходима экстракция каким-либо растворителем из нативных или дезинтегрированных клеток (система "твердое тело-жидкость").

Примерная схема выделения целевого антимикробного продукта из культуральной жидкости может быть представлена в следующем виде. В приведенную схему должны быть внесены соответствующие коррективы в зависимости от физико-химических характеристик целевого продукта и возможностей аппаратурного оформления процесса. В настоящее время все большее распространение приобретают мембранные методы концентрирования и выделения различных веществ, хотя до сих пор в ряде производств БАБ (включая антибиотики, например, пенициллин) не удалось отказаться от традиционных способов выделения и очистки целевых продуктов (экстракция в системе "жидкость-жидкость", адсорбция на активированных углях, диализ).

Рис. Примерная технологическая схема выделения антибиотика из культуральной жидкости (КЖ): I - предварительная обработка КЖ, 2 - подготовка раствора, 3 -- первый фильтр, 4 - сборник первого фильтра, 5подготовка раствора для фильтрации, 6 -- дополнительная фильтрация, 7 - стерилизующая фильтрация, 8 -коагуляция растворителем, 9-предварительное осаждение, 10 - промывание осадка, 11- вторичное осаждение, 12- высушивание.

В сравнительном плане следует иметь в виду, что механическое обезвоживание заметно дешевле термического и это сказывается на себестоимости производимого продукта.

Также широко используют методы хроматографии, например, при выделении новобиоцина, стрептомицина и других антибиотиков. В подобных случаях технологическая схема аппаратурного оформления процессов заметно упрощается.

ЛИТЕРАТУРА:

Биотехнология/под ред. И. Хиггинса, Д. Беста, Дж. Джонса/перевод с английского/под ред. А. А. Баева. - М.: Мир, 1988. - 479 с.

Биотехнология микробного синтеза/под ред. М. Е. Бекера - Рига: Зинатне, 1980. - 350 с.

Воробьев Л. И. Техническая микробиология. - М.: Высшая школа, 1987. - 94 с.

Д е б а б о в В. Г., Лившиц В. А. Биотехнология. - М.: Высшая школа, 1988.

Кн. 2. Современные методы создания промышленных штаммов микроорганизмов. 1988. - 208 с.

Промышленная микробиология и успехи генетической инженерии. Сборник: перевод с английского под ред. Г. К- Скрябина. - М.: Мир, 1984. - 172 с.

Смирнов В. А. Пищевые кислоты. - М.: Легкая и пищевая промышленность, 1983. - 240 с.

Basic biotechnology Ed. by John Bu'Lock and Bjern Kristiansen.- Acad. Press, London, Orlando San Diego, New York, Austin, Boston, Sydney Tokio, Toronto, 1987. - 561 p.